EVALUATION DU POUVOIR ANTIOXYDANT

Gérard Gomez

Plan de l'étude

1) Introduction

2) Tests d'évaluation du pouvoir antiradicalaire

2-1) Test DPPH

2-2) Test utilisant l'ABTS

2-3) Test ORAC

2-4) Test FRAP

Annexe 1 Le trolox

Annexe 2 La fluorescéine

ANNEXE 3 Produits de dégradation de la fluorescéine en présence de AAPH

Annexe 4 L'acide ascorbique

1) Introduction

Selon le règlement européen CE/1333/2008 , les antioxydants sont "des substances qui prolongent la durée de conservation des denrées alimentaires en les protégeant des altérations provoquées par l'oxydation telles que le rancissement des matières grasses et les modifications de la couleur".

Ce sont en général des radicaux possédant une très grande réactivité et présents dans l'air qui sont impliqués dans les dégradations oxydatives des aliments et qui entrainent des modifications au niveau sensoriel et nutritionnel de ceux-ci.

Un exemple de mécanisme d'altération d'un lipide à l'air par un radical HO* :

Le radical arrache un hydrogène à un lipide et initie une réaction en chaîne qui peut aboutir à un alcool (peroxydation lipidique)

Certains antioxydants (dits antiradicalaires) que nous désignerons par AH bloquent les radicaux lipidiques par transfert d'un hydrogène et empêchent la réaction en chaîne :

Ce sont les espèces réactives de l'oxygène (ERO) qui entraînent cette altération des aliments.

Parmi elles le radical hydroxyle HO*est le plus actif donc le plus délétère pour les matériaux biologiques. Le radical superoxyde O₂^{* -} est assez peu réactif vis-à-vis de la plupart des substrats bioorganiques, il a surtout un effet indirect en conduisant au radical HO*.

Parmi les antiradicaux on peut citer les polyphénols :

Exemple du catéchol

Considérons un composé BH susceptible d'être transformé en B* par une espèce réactive de l'oxygène. Il peut être protégé par le catéchol qui lui fournit un hydrogène et lui permet de redevenir BH au lieu d'être oxydé.

Il existe plusieurs types de systèmes antioxydants :

- Les enzymes antioxydantes : superoxydes dismutase, glutathion peroxydase, catalase …..

- Des molécules à haut poids moléculaire : albumine, ferritine et autres protéines.

- Des molécules de plus petites tailles : acide ascorbique, acide urique, tocophérol, caroténoïdes, polyphénols ….

- Certaines hormones : oestrogènes, mélatonine ….

Les antioxydants peuvent désactiver les radicaux par deux mécanismes principaux :

- Transfert d'hydrogène (HAT Hydrogène Atom Transfer)

- Transfert d'électron (SET Single Electron Transfer).

SET et HAT ont lieu la plupart du temps ensemble dans les échantillons.

2) Tests d'évaluation du pouvoir antiradicalaire

Plusieurs méthodes ont été développées pour la détection de l'activité antioxydante.

2-1) Test DPPH*

Le 2,2-Diphényl-1-picrylhydrazyle ou DPPH^* radical

est un radical relativement stable, de couleur violette qui devient jaune par réduction (il devient du DPPH-H).

Le test DPPH* permet de mesurer l'aptitude d'un antioxydant comme par exemple un composé phénolique à réduire le DPPH* et mesure donc le pouvoir antiradicalaire de molécules ou d'extraits végétaux dans un système donné.

Principe du test

On fait réagir une solution contenant l'antioxydant (molécule pure ou extrait) AH avec une solution de DPPH*

On peut apprécier la réduction du DPPH* par spectrométrie à 517 nm.

Cette réduction sera plus ou moins rapide selon la nature de l'antioxydant (figure 1) et la quantité de DPPH-H formé dépendra de la concentration en antioxydant (figure 2).

Cinétique de réduction de DPPH* pour deux antioxydants

Cinétique de réduction de DPPH* pour un antioxydant

à différentes concentrations.

Figure 1

Figure 2

Figure 1

On trace la courbe cinétique de réduction d'une même quantité de DPPH* pour deux antioxydants, on s'aperçoit qu'elles ne sont pas identiques : L'oxydant B agit plus vite que le A et le % résiduel de DPPH* au plateau est plus faible.

Figure 2

On trace la courbe cinétique de réduction d'une même quantité de DPPH* pour un même antioxydant à différentes concentrations : Plus la concentration augmente plus la réaction est rapide et plus le % résiduel de DPPH* est faible au plateau.

Figure 3

On trace la courbe du % résiduel de DPPH* au plateau, en fonction de la concentration en antioxydant (courbe effet-dose) et on détermine le CE₅₀.

Courbe Effet-Dose – Détermination du CE₅₀

Figure 3

La concentration efficace en antioxydant nécessaire pour réduire 50% du DPPH* initial est notée CE₅₀ ; elle est dans notre exemple de 1,35 mg/L environ (voir figure 3).

Plus le CE₅₀ est faible et plus l'antioxydant est efficace.

Remarques :

- On définit l'efficacité antiradicalaire (Antiradical Efficiency) et on la désigne par AE₅₀, l'expression AE₅₀ = 1/EC₅₀ ; on voit que plus AE₅₀ est grande et plus l'antioxydant est efficace.

- Le pouvoir antioxydant d'une substance n'a pas de sens en valeur absolue ; le plus souvent on l'exprime en valeur relative en prenant comme référence une substance donnée à fort effet antioxydant ; c'est souvent le Trolox (voir annexe 1). La capacité antioxydante en équivalent Trolox (TEAC) correspond à la concentration (mg/L) de Trolox ayant la même activité que la solution de la substance à tester à concentration unitaire.

2-2) Test utilisant l'ABTS*⁺

C'est une méthode semblable à celle utilisant le radical DPPH*⁺.

Il permet de voir quelle est la capacité des antioxydants à neutraliser le radical ABTS*⁺.

L'ABTS est l'acide 2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique)

ABTS*⁺ peut être généré

- par des réactions chimiques (action du persulfate de potassium par exemple)

Ce processus de production du radical ABTS*⁺ est assez lent et nécessite un léger chauffage.

- par des réactions enzymatiques

On peut utiliser de la raifort peroxydase par exemple en présence d'eau oxygénée (H₂O₂).

Généralement ces réactions enzymatiques sont plus rapides et plus douces.

En présence d'un antioxydant donneur de H* (comme le trolox par exemple), l' ABTS*⁺ est réduit en ABTSH⁺ :

ORAC 5.gif

Le radical cationique ABTS*⁺est de couleur bleue avec un pic d'absorption à 734 nm. Il réagit avec la plupart des antioxydants, notamment les phénols, les thiols ou la vitamine C en perdant sa couleur bleue et en retrouvant son état neutre incolore. On peut donc suivre ces réactions par spectrophotométrie.

Cette mesure permet de comparer le pouvoir antiradicalaire de différents antioxydants par rapport à celui du Trolox pris comme référence ; La capacité antioxydante en équivalent Trolox (TEAC) correspond à la concentration (mg/L) de Trolox ayant la même activité que la solution de la substance à tester à concentration unitaire.

2-3) Test ORAC

L'évaluation du pouvoir antioxydant d'une substance peut se faire par la méthode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity : Capacité d'absorption des radicaux dérivés de l'oxygène) dont le principe est le suivant :

On met en présence une sonde fluorescente sensible à l'oxydation (la fluorescéine (voir annexe 2) : excitation 487 nm , émission 515 nm) et un générateur de radicaux, par exemple le chlorhydrate de 2,2'-azobis(2-amidinopropane) ou AAPH un composé oxydant thermolabile qui donne à 37°C des radicaux peroxyles (R-O-O*) ; l'oxydation de la fluorescéine entraîne une diminution de sa fluorescence au cours du temps (figure 1 …"Sans antioxydant").

Le chlorhydrate de 2,2'-azobis(2-amidinopropane) ou AAPH a pour formule

En présence d'oxygène et chauffé à 37°C, il donne des radicaux peroxyles :

La présence d'un antioxydant retarde la perte de fluorescence (Figure1).

La fluorescéine donne des produits de dégradation (voir annexe 3).

Pour quantifier le pouvoir antioxydant d'une substance on peut comparer son effet sur l'intensité relative de fluorescence de la sonde en fonction du temps à l'effet d'une substance de référence (on prend souvent le Trolox) (Figure 2).

Le potentiel antioxydant est déterminé par la différence d'aire sous la courbe de l'antioxydant évalué, avec l'aire sous la courbe du Trolox (surface en jaune dans la figure 2) ; il est exprimé en concentration équivalente de Trolox ; 1 unité ORAC équivaut à 1 µmole de Trolox par g ou pour 100g (extraits et fruits) ou 1 µmole de Trolox par µmole de composé pur.

Ce test est applicable sur les végétaux (plantes, fruits, légumes) et leurs produits dérivés.

Plus l'indice ORAC est élevé et plus la substance a un pouvoir antioxydant élevé.

Quelques valeurs d'indice ORAC pour quelques substances :

Substances	Indice ORAC en µmol TE/100g	Substances	Indice ORAC en µmol TE/100g	Substances	Indice ORAC en µmol TE/100g
Haricots	8033	Noix	13541	Clou de girofle (poudre)	290283
Lentilles	7282	Prunes	6100	Cannelle	267536
Choux	1359	Grenades	4479	Persil	74349
Tomates	337	Pommes	3898	Cacao (poudre)	55653
Concombres	140	Oranges	2103	Poivre	27618

Remarque :

L'USDA (département de l'agriculture des Etats-Unis) a publié une liste de 326 aliments avec des indices ORAC rapportés à 100g de matière. Cette liste a été retirée quelques temps après, en révélant qu'il n'y avait pas de preuves scientifiques sur la corrélation entre l'action antioxydante et les effets bénéfiques attribués aux substances individuelles.

2-4) Test FRAP (Ferric Reducing Antioxydant Power)

C'est une méthode colorimétrique de transfert d'électrons (SET) permettant de mesurer la capacité d'un antioxydant à réduire le complexe ferrique-tripyridyltriazine Fe(III) (TPTZ)₂ de couleur jaune en cation ferreux- tripyridyltriazine fe(II)(TPTZ)₂ de couleur bleue, qui absorbe à 593 nm.


Complexe Fe(III)(TPTZ)₂	Complexe fe(II)(TPTZ)₂

La réaction correspond à :

La valeur d'absorbance obtenue par spectrophotométrie permet de corréler la quantité de fer réduite (obtenue par étalonnage avec des solutions de fer(II)) avec la quantité d'antioxydant. Le Trolox ou l'acide ascorbique (annexe 4) sont utilisés comme références.

Annexe 1

Le trolox

Acide 6-hydroxy-2,5,7,8- tétraméthylchromane-2- carboxylique.

C₁₄H₁₈O₄

Masse molaire

250,290 g.mol^-1

Solubilité

Soluble dans l'eau

N° CAS

53188-07-1

Le trolox

L'α-tocophérol

Cette molécule est un analogue de l'α-tocophérol, un des constituants de la vitamine E ; elle est soluble dans l'eau et possède un fort effet antioxydant.

C'est un inhibiteur des dommages occasionnés par l'oxydation sur les membranes des cellules.

On s'en sert comme référence pour estimer la capacité antioxydante d'une substance (TEAC).

ANNEXE 2

La fluorescéine

Matière colorante obtenue par déshydratation d'un mélange d' anhydride phtalique et de résorcinol. Elle se présente sous forme d'une poudre rouge, qui donne à l'eau une couleur "vert fluo" même à l'état de trace.

Annexe 3

Produits de dégradation de la fluorescéine en présence de AAPH.

AnneXe 4

L'acide ascorbique

L'acide ascorbique est un réducteur, sa fonction énol étant très oxydable.
Lorsqu'il a été oxydé il devient l'acide déhydroascorbique (Dha):