CHROMATOGRAPHIE


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1) Généralités
2) Les différentes méthodes chromatographiques
3) Réalisation d'une CCM
4) Chromatographie en Phase Gazeuse


1) Généralités :

1-1) Expérience de base : TSWETT (1905) réalise une expérience, comparable à la suivante, qui a été le point de départ d'une technique d'analyse aujourd'hui très répandue:



Interprétation : les pigments verts sont en fait un mélange de pigments de plusieurs couleurs. En se déplaçant
sélectivement sous l'effet du solvant (ou éluant) au travers de la colonne, les différents pigments se séparent.


- la poudre, immobile lors de l'expérience, est appelée phase fixe ou stationnaire.
- le solvant qui en se déplaçant entraîne le mélange et participe à sa séparation est appelé phase mobile ou éluant.
 


- une phase fixe,
- une phase mobile.

2)Les différentes méthodes chromatographiques :


- si l'éluant est un gaz: Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG).
- si l'éluant est un liquide: Chromatographie en Phase Liquide (CPL).

a) phase stationnaire: solide doué de propriétés adsorbantes (comme dans l'expérience de Tswett), on parle de Chromatographie d'adsorption.
b) phase stationnaire: liquide (non miscible à l'éluant) fixé sur un solide qui sert de support inerte; on parle de Chromatographie de partage.
c) phase stationnaire: gel constituant un tamis : Chromatographie par perméation de gel ou d'exclusion.
d) phase stationnaire: résine échangeuse d'ions: Chromatographie par échange d'ions.
Remarque : Polarité des phases
On peut faire de la chromatographie :
- à polarité de phase normale : la phase stationnaire est plus polaire que la phase mobile.
- à polarité de phase inverse : la phase stationnaire est moins polaire que la phase mobile. La phase stationnaire apolaire est souvent de la silice greffée avec des alcanes : SiOR avec R souvent une chaîne alkyle en C18.
Dans la très grande majorité des cas, on fait de la chromatographie en phase normale.


a) Chromatographie d'adsorption :
La phase fixe est souvent de la silice (en gel), de l'alumine, des adsorbants organiques copolymères (vinylbenzène/divinylbenzène), charbon actif....

b) Chromatographie de partage :
*Le support peut-être du gel de silice, de la poudre de cellulose, ou du "papier" (cellulose très pure), ou des polymères synthétiques.
*La phase stationnaire, un solvant polaire ( eau, solutions acides ou alcalines...)

c) Mode de migration du solvant :

* le solvant monte : chromatographie ascendante (exemple: Chromatographie en couche mince) :

* le solvant descend : chromatographie descendante (colonne ou papier).

* le solvant migre tour à tour dans 2 directions perpendiculaires avec changement d'éluant : chromatographie bidimensionnelle.

On fait tourner la feuille de 90°

d) Révélation des constituants du mélange après séparation:

Rarement les composés sont colorés. Pour les détecter il faut souvent :

- pulvériser un réactif qui colore les taches (ninhydrine pour les amino-acides)

- opérer en lumière U.V. (voir CCM avec indicateur de fluorescence).

- opérer un comptage de radioactivité si les composés contiennent des éléments radioactifs.
 

e) HPLC ou CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance :

C'est une CPL sur mini-colonnes avec un solide si fin (micronisé) qu'il faut travailler sous pression (10 à 200 bars) pour que l'éluant puisse les traverser.

3) Réalisation d'une CCM (Chromatographie en couche mince) :
          3-1) But: par exemple, vérifier la pureté d'un composé obtenu par synthèse : le 4-nitroacétanilide obtenu par nitration de l'acétanilide.

Cette opération conduit à un mélange de 4-nitroacétanilide

et de 2-nitroacétanilide
.
Par recristallisation dans l' éthanol, on élimine le 2-nitroacétanilide. On souhaite vérifier l'efficacité de la purification en procédant à une CCM sur le produit brut et le produit pur.

3-2) Type de chromatographie utilisée :
Il s'agit d'une chromatographie d'adsorption (la phase fixe est une mince couche d'alumine déposée sur une plaque d'aluminium) en phase liquide (l'éluant est un liquide) ascendante (l'éluant se déplace de bas en haut).
Remarque 1 :La plaque doit être mise dans une cuve à fond plat (un bécher pourra à la rigueur convenir).
Remarque 2 :L'éluant ne doit pas réagir avec les constituants du mélange. Il est choisi en fonction de son aptitude à entraîner les substances à séparer : plus celles-ci sont polaires, plus l'éluant doit lui-même être polaire. On peut classer différents liquides suivant un ordre croissant de leur polarité, on définit ainsi une série éluotropique : Ether de pétrole, cyclohexane, tétrachlorométhane, trichloroéthylène , toluène, dichlorométhane, éthoxyéthane, trichlorométhane, éthanoate d'éthyle, pyridine, propanone, propan-1-ol, éthanol, méthanol, eau, acide éthanoïque.
Remarque 3 : Plus la substance à entraîner est soluble dans la phase mobile plus elle migrera avec cette phase par capillarité le long du support fixe.  On peut aussi classer par ordre croissant de polarité les groupes fonctionnels : RH, RX, RNO2, (ROR, RCOOR, RCOR, RCHO), RCONHR, (RNH2, R2NH, R3N), H2O, ArOH, RCOOH.
3-3) Réalisation :


Remarque : composition de l'éluant: éthanoate d'éthyle/méthanol/diéthylamine (80/10/10).
 

 

§  La révélation se fait sous la lampe UV ; la plaque à utiliser doit alors contenir un indicateur de fluorescence ; on utilise couramment deux indicateurs :

- Du silicate de zinc activé au manganèse dont la fluorescence se produit à 254 nm ; elle est verte.

- Un autre pigment minéral dont la fluorescence se produit à 366 nm ; elle est dans le bleu.

Pour produire ces UV on utilise une lampe à vapeur de mercure et on élimine les radiations inutiles par des filtres.

 

3-4) Calcul des Rf :
 

Rf1= d1/d         Rf2 = d2/d            Rf3  = d3/d

4) Chromatographie en Phase Gazeuse (ou Vapeur) : CPG ou CPV

    4-1) Les différents éléments d' un chromatographe :
 

SCHEMA DE PRINCIPE

UN CHROMATOGRAPHE DE DEMONSTRATION

    - La colonne peut être capillaire (fraction de mm d' épaisseur) ; elle est remplie d' une phase fixe qui dépend du type de chromatographie que l'on souhaite réaliser ( d'adsorption ou de partage).
    - Le gaz vecteur peut être de l'hélium, de l'azote, de l'hydrogène .......
    - Le four permet de porter la colonne à une température fixe ou variable (gradient de température programmé)
    - L 'injecteur, dans lequel on envoie le mélange à analyser au moyen d'une microseringue (volumes injectés de l'ordre de la fraction de mL) est porté à une température supérieure à celle du four.
    - Le détecteur peut être, soit de type cataromètre (2 résistances trés sensibles montées en pont de wheatstone, avec 2 autres résistances ; l'une est balayée uniquement par le gaz vecteur, l'autre par le gaz vecteur plus le constituant lorsqu' il lui parvient ; du déséquilibre qui s'ensuit naît le pic observé), détecteur à ionisation de flamme(FID), .......
    - L'enregistreur permet l'observation des pics et l'édition de l'analyse (traduction en % de la surface des pics détectés, ainsi que temps de rétention).
    - Un intégrateur couplé à l'appareil permet de calculer la surface des pics détectés.
    4-2) Les résultats obtenus :
Après préparation du 2-méthylbut-2-ène par déshydratation par l'acide phosphorique, on obtient le chromatogramme ci-dessous qui révèle deux pics, l'un dû au produit préparé (produit majoritaire) l'autre dû à un isomère formé au cours de la déshydratation (2-méthylbut-1-ène, produit minoritaire).

   - Le temps de rétention est caractéristique du constituant (dans des conditions données de température  du four et de pression , débit, nature, du gaz vecteur), que celui-ci soit pur ou mélangé.
    - La surface sous le pic est proportionnelle à la quantité de constituant.

     4-3) Un chromatographe de laboratoire :