LUMINESCENCE

Lors du départ de CO₂, la coelentéramide se trouve dans un état excité. Le retour à l'état stable s'accompagne d'une libération d'énergie qui se traduit par l'émission d'une lumière bleue (460<λ<480nm).

2- Varguline

C'est une luciférine qu'on trouve chez certains crustacés ostracodes (Vargula) et chez des poissons des grandes profondeurs.

Le mécanisme est le même que celui de la coelentérazine.

On trouve en effet, en ce qui concerne la partie de la molécule qui est affectée, les mêmes structures, avec mise en place d'une fonction amide –CO-NH- à la place du cycle imidazolone

3- Luciférine des dinoflagellés

3-1 Les dinoflagellés sont des protozoaires munis d'un flagelle comme leur nom l'indique.

En nombre considérable, ils sont généralement responsables de territoires lumineux à la surface des océans la nuit. Ce sont les noctiluques du plancton.

Leur luciférine est une molécule qui ressemble à celle de la chlorophylle :

LUMINESCENCE5

3-2 En se limitant à la partie de la formule utile aux explications, où le noyau pyrrole a un côté commun avec un autre noyau pentagonal (en bas à droite de la figure), on peut mettre en évidence qu'à l'air il se forme un produit d'oxydation avec un hydroperoxyde comme intermédiaire.

4- Luciférine des bactéries

4-1 Ces bactéries se retrouvent dans des animaux de grande taille (calmars, poissons, ….) qui les ont consommés et peuvent leur communiquer une certaine luminosité.

Le processus est une oxydation par l'oxygène mais il se complique du fait qu'il fait intervenir une luciférine accompagnée d'un co-facteur ; ici un aldéhyde.

4-2 La luciférine est la forme réduite d'une flavine nucléotide.

Rappelons ici l'origine de la structure d'une telle molécule :

L'acide phosphorique donne la riboflavine-phosphate encore appelée flavine mononucléotide (FMN) :

FMN

La luciférine est la flavine mononucléotide réduite (FMNH₂) :

FMNH2

On remarquera son oxydation qui correspond au départ de 2H qui étaient fixés, chacun sur 1N de chaque noyau azoté.

4-3 L'équation-bilan de la bioluminescence s'écrit :

Il doit se former un hydroperoxyde

LUMINESCENCE9

qui oxyde l'aldéhyde.

5- Luciférine de Latia

Latia neritoides est un gastéropode d'eau douce, à coquille conique évasée (famille des patelles).

Sa luciférine est un ester de l'acide formique (méthanoïque) :

LUMINESCENCE10

La réaction conduisant à la luminescence, nécessite la présence d'un co-facteur donneur d'hydrogène qui est mal connu et désigné ici par AH₂.

Equation-bilan

LUMINESCENCE11

Cette réaction peut donc être comparée à celle vue précédemment avec les bactéries luminescentes, mais ici le co-facteur AH₂ serait de nature protéinique et, après oxydation, A comporterait une fonction cétone.

6- Luciférine des vers luisants

6-1 Ver est une appellation incorrecte pour désigner ces insectes coléoptères, lucioles et lampyres, espèces très voisines, souvent confondues. Le ver luisant le plus connu est la femelle du lampyre. Ces animaux ont le plus souvent des dimensions de l'ordre du centimètre. On observe un point lumineux très brillant, jaune-verdâtre dans une prairie ou un jardin. Mais Pyrophorus noctilus est un gros coléoptère dont les Indiens se servaient pour éclairer leurs cases.

6-2 La formule de la luciférine est :

Les étapes de la réaction de bioluminescence, assez complexes, sont maintenant bien connues. Le processus nécessite de l'ATP et des ions Mg²⁺.

La luciférine est transformée en

Il y a émission d'une lumière vert-jaune.

6-3 Détaillons les étapes :

Rappel et notations

Les explications feront appel :

à l'ATP (adénosine triphosphate)

Cette molécule est bien connue comme étant indispensable à la réalisation d'un grand nombre de processus biologiques

ATP

à l'AMP (adénosine monophosphate)

Formule analogue à l'ATP avec deux groupements phosphoriques en moins.

à l'ion pyrophosphate

LUMINESCENCE14

cet ion P₂O₇^4- sera noté P_r

Pour alléger l'écriture nous ne représenterons que la partie de la molécule de luciférine qui subit des transformations (à droite sur la figure)

Le carbone du cycle qui porte la fonction –COOH est un carbone asymétrique de configuration (S).

6-4 Application : dosage de l'ATP

L'ATP étant un composé fondamental de la matière vivante, régulant les échanges d'énergie dans la grande complexité des réactions biochimiques, l'intérêt de ce dosage est évident.

On utilise de la luciférine et il existe des relations entre l'intensité lumineuse émise et la concentration en ATP.

C – Les photoprotéines

1- Aequorine

La coelentérazine de la méduse Aequorea peut donner lieu à une émission de lumière en l'absence d'enzyme mais par contre en présence de calcium.

1-1 On a fait une étude in-vitro

La coelentérazine s'associe à une protéine ; l'ensemble a été nommé "aequorine". En présence de Ca²⁺, la conformation de la protéine se modifie. Trois ions Ca²⁺ se fixent sur des sites privilégiés de la protéine. On a donc un complexe coelentérazine – protéine - Ca²⁺.

L'oxygène est amené à réagir sur la coelentérazine ; on aboutit à la coelentéramide sous forme excitée comme dans le cas où le processus est enzymatique, avec les mêmes intermédiaires : hydroperoxyde, dioxétanone (voir partie B – coelentérazine).

Le retour à l'état stable de la coelentéramide s'accompagne d'une émission de lumière

1-2 Cette étude in-vitro donne une lumière bleue (λ = 468 nm)

La lumière de la méduse n'est pas bleue mais verte parce qu'in-vivo il y a un autre passage du complexe coelentérazine – protéine – calcium, appelé BFP (blue fluorescent protein) à un complexe comportant une autre protéine, appelé GFP (green fluorescent protein). Il en résulte la libération d'une quantité d'énergie un peu plus faible ; la longueur d'onde est de l'ordre de 500 nm (vert).

1-3 Application

Cette bioluminescence permet de faire des mesures de Ca²⁺ libre dans les cellules vivantes.

2-Vue générale sur les photoprotéines

D'une façon générale les photoprotéines peuvent être considérées comme des hétéroprotéines dont le groupement prosthétique – une luciférine – est un chromophore.

En l'absence de luciférase, après une phase d'oxydation, ce dernier se détache à l'état excité.

Un retour à l'état stable engendre un départ d'énergie sous forme lumineuse.

Sont luminescents grâce à des photoprotéines diverses espèces de méduses (Aequorea), de mollusques lamellibranches (pholades), d'annélides (vers polychètes), ….

D – Luminescence des champignons

Un certain nombre de champignons supérieurs sont lumineux.

Leur lueur est faible mais peut se voir dans un bois la nuit.

La plupart sont de la famille des mycènes, mais on trouve aussi des marasmes et des armillaires.

Les résultats des études ne sont pas encore très nombreux.

Leur luciférine aurait un précurseur, molécule appelée panal (de Panellus stipticus, un mycène) :

Il est accompagné d'un co-facteur, le NADH (nicotinamide – adénine –dinucléotide hydrogéné)

NADH

NB : nucléotide = base organique azotée + ose + H₃PO₄

On reconnaît la nicotinamide et l'adénine. C'est la nicotinamide qui est hydrogénée.

E – Conclusion

1- De nombreuses espèces n'ont pas été citées.

L'exploration du monde sous-marin ne fait que commencer.

La connaissance de mécanismes faisant souvent intervenir des hydroperoxydes et la structure dioxétanone

LUMINESCENCE18

a incité les chercheurs à s'intéresser à la luminescence de molécules organiques à caractère non biologique.

La bioluminescence est la chimiluminescence des réactions biochimiques.

F – Prix Nobel pour des études sur la bioluminescence

En 2008 trois chercheurs se sont vus attribués le Prix Nobel de Chimie pour leurs travaux sur la bioluminescence ; ce sont

SHIMOMURA Osamu

Il étudie la bioluminescence de la méduse Aequorea victoria qui avait été remarquée quelques années auparavant et met en évidence, en 1962, deux protéines à l'origine de cette fluorescence : l'aequorine et la GFP (Green Fluorescent Protein). Entre 1969 et 1971, il décrit, avec son équipe, le mécanisme de cette luminescence.

CHALFIE Martin

Il a l'idée d'utiliser dans les années 1990 la GFP (Green Fluorescent Protein) mise en évidence dès 1962 par l'équipe du Professeur Osamu Shimomura comme marqueur biologique pour dresser la carte du Caenorhabditis elegans un ver microscopique qui sert de modèle en génétique et qui est transparent.

TSIEN Roger

Avec son équipe il met en évidence le rôle de l'oxygène dans le mécanisme de la fluorescence de la GFP (Green Fluorescence Protein) découverte par Shimomura dans les années 1960. Il modifie la structure biochimique de cette protéine afin de lui faire émettre de la lumière fluorescente dans une large gamme de couleurs (du bleu au jaune) élargissant ainsi la palette des marqueurs luminescents.

G – Rôle de la bioluminescence chez certains animaux

On attribue quatre fonctions principales à ce phénomène chez certains animaux :

- l'éclairage

- l'attraction des proies

- la protection contre les prédateurs

- la communication.

CHIMIOLUMINESCENCE ou chimiluminescence.

A – Définition

1- On appelle chimioluminescence l'émission de lumière produite par une réaction chimique.

Plus précisément, certaines molécules portées à un état excité reviennent à un état stable en restituant de l'énergie sous forme de lumière.

Il existe différentes manières de provoquer l'émission de lumière ; par exemple, certaines molécules irradiées par des ultraviolets émettent de la lumière visible.

Si l'excitation est due à une réaction chimique, cette émission est appelée chimioluminescence.

2- Les mécanismes de la chimioluminescence ont d'abord été étudiés sur des réactions de biochimie. La bioluminescence, de plus en plus explorée, concerne la production de lumière par toutes sortes d'organismes vivants. L'étude des réactions de bioluminescence a conduit à s'intéresser à la chimioluminescence de façon générale.

3- La plus connue des réactions chimiques avec émission de lumière est l'oxydation du phosphore blanc à l'air.

En 1913 on découvre la luminescence du luminol quand on l'oxyde en milieu basique par l'eau oxygénée ou l'eau de Javel.

Puis on constate que la décomposition de certains peroxydes s'accompagne d'une luminescence. Mais en général l'intensité observée est très faible.

4- Actuellement, une étude systématique montre que la chimioluminescence repose sur trois principes de base possibles :

Soit la présence comme intermédiaire de peroxydes et d'une structure dioxéthanone dont la décomposition produit des molécules excitées

Soit l'existence de radicaux
Soit la présence d'oxygène singulet, structure électronique particulière de la molécule O₂ qui apparaît dans certaines réactions.

5- Si le phénomène lumineux cesse dès que la cause disparaît, il y a fluorescence.

Si le phénomène lumineux persiste un certain temps (quelques minutes, plusieurs heures, ….) après disparition de la cause, on parle de phosphorescence.

On explique ce retard par la difficulté qu'aurait le système à retrouver un état stable, notamment à cause de retournements de spins d'électrons.

NB : L'oxydation du phosphore blanc à l'air ne dure que tant qu'il reste du phosphore. C'est une luminescence, improprement appelée phosphorescence dans le langage courant.

B – Luminescence mettant en jeu peroxydes et dioxéthanone

1- Luminol

1-1 Le luminol est oxydé par l'eau oxygénée en milieu basique.

Equation-bilan :

LUMINESCENCE20

En pratique l'oxydation ne se fait à vitesse appréciable que si la réaction est catalysée par Fe³⁺ ou mieux encore, Fe(CN)₆^3-

1-2 Le luminol est connu depuis longtemps ; le mécanisme de l'oxydation a été élucidé

La décomposition de l'eau oxygénée engendre des radicaux HO.

LUMINESCENCE21

Mais l'eau oxygénée réagit sur cette molécule

LUMINESCENCE22

Dans l'avant dernière étape du mécanisme, un réarrangement de l'oxygène après départ d'azote conduit à un composé excité

LUMINESCENCE23

La désexcitation est responsable de l'émission de lumière soit :

LUMINESCENCE24

1-3 Application

Le luminol sert à détecter les traces de sang, notamment dans les enquêtes sur les crimes.

On vaporise un mélange de luminol et d'eau oxygénée sur la surface à étudier. Le fer Fe²⁺ de l'hémoglobine est transformé en Fe³⁺ par l'eau oxygénée et sa présence assure la catalyse de la réaction de luminescence. Il se produit une lueur bleue assez fugitive.

2- Oxalate de diphényle

2-1 L'oxalate de diphényle est oxydé par l'eau oxygénée

Le dioxyéthanedione se décompose spontanément en CO₂ en produisant de l'énergie.

Si le milieu réactionnel est additionné d'un colorant approprié (fluorophore), ce dernier peut capter l'énergie, ce qui lui donne un état excité. La molécule de colorant se désexcite en émettant de l'énergie lumineuse. C'est un phénomène de fluorescence

-Voir annexe 1-

2-2 On a essayé plusieurs dérivés de l'oxalate de diphényle et toute une série de colorants fluorophores. Une qualité essentielle de la molécule d'un bon colorant fluorescent est de posséder un grand système de doubles liaisons conjuguées. Il s'agit de molécules à noyaux aromatiques condensés ou de molécules cycliques planes possédant des liaisons π.

La couleur de la lumière dépend du fluorophore. Citons quelques fluorophores, avec indication de la lumière fluorescente produite :

BLEU VERT JAUNE

EOSINE

NB : Ne pas confondre la couleur du produit et la fluorescence. Par exemple, le rubrène est rouge ; il donne une fluorescence jaune.

2-3 Application

Les bâtons lumineux.

Ils sont appelés assez souvent "tubes cyalume®".

Dans un tube flexible en matière plastique on introduit de l'oxalate de diphényle, un fluorophore et une ampoule de verre contenant de l'eau oxygénée.

En fléchissant le tube, on casse l'ampoule, le mélange réactionnel se fait et le bâton devient lumineux.

Suivant les quantités de réactifs en présence, on peut obtenir une émission intense mais de courte durée ou une émission plus faible mais qui dure longtemps.

Les tubes de grande taille sont employés comme éclairage de secours.

On peut aussi donner aux tubes diverses formes pour en faire des objets décoratifs (bracelets, colliers, ….).

3- Acridinium

3-1 La fluorescence peut se manifester avec des composés de l'acridine.

ACRIDINE

Mais sous la forme acridinium, les résultats sont plus satisfaisants.

Exemple de sel d'acridinium

ACRIDINIUM

D'ailleurs, les réactions envisagées nécessitent un milieu basique ; on conçoit qu'on passe d'une forme à l'autre facilement.

Enfin, les molécules les plus connues susceptibles de donner lieu à fluorescence sont des esters : des acridinium-9-carboxylates.

Remarque : Il est utile de noter la numérotation traditionnelle des sommets de l'acridine :

3-2 Considérons l'oxydation par l'eau oxygénée du N-méthyl acridinium -9- carboxylate de phényle

Mais l'acridinone excitée peut également céder son énergie à un fluorophore par exemple la rhodamine B

On rappelle que c'est le fluorophore qui impose la longueur d'onde de la lumière émise.

3-3 Application

Grâce à la fluorescence, des composés acridiniums peuvent servir au suivi d'une protéine.

Par exemple avec

liée à un anticorps, on peut faire des dosages immunologiques en réalisant la réaction dans un fluoromètre.

C – Luminescence mettant en jeu des radicaux

1- Oxydes d'azote

1-1 Le monoxyde d'azote NO de l'atmosphère peut-être dosé dans un analyseur où on injecte de l'ozone, en mesurant l'intensité lumineuse de la réaction

OXYDESDAZOTE

1-2 On peut également détecter des explosifs nitrés (TNT,….) sous forme d'aérosols, après leur avoir fait subir une pyrolyse.

En représentant très schématiquement un explosif nitré par R-NO₂

.NO₂ est la formule classique du dioxyde d'azote. Elle comporte un électron célibataire

NODEUX

.NO₂ est évidemment écrit NO₂.

On réduit NO₂ en NO en utilisant du molybdène comme catalyseur et on procède comme indiqué au début du paragraphe (action de O₃) pour avoir NO₂*

1-3 On conçoit qu'on peut mesurer la quantité totale de NO et de NO₂ de l'atmosphère en opérant en deux temps sur le mélange : sans réduction et avec réduction.

2- Phosphore blanc

Le phosphore a été découvert au XVII^ème siècle.

On sait que l'oxydation lente du phosphore blanc s'accompagne d'une fluorescence verdâtre, visible dans l'obscurité.

Pourtant, le mécanisme de ce phénomène est encore mal connu. L'hypothèse la plus souvent avancée met en jeu des radicaux oxygène O.

D – Luminescence mettant en jeu l'oxygène singulet

1- Qu'est-ce que l'oxygène singulet ?

1-1 La formule électronique de l'oxygène est 1s² 2s² 2p⁴

La molécule de O₂ dans son état stable habituel n'a pas la structure

qu'on peut imaginer.

Le paramagnétisme de l'oxygène oblige à considérer que la molécule comporte deux électrons à spins parallèles.

Diagramme des orbitales au niveau 2p :

SPINSO2

On peut adopter la représentation

On dit que la molécule O₂ est dans un état triplet parce que, à cause des spins s = +1/2 et s = +1/2 des électrons des orbitales π_x et π_y, la quantité 2s + 1 de la règle de quantification, est égale à 3. Et on adopte la notation ⁽³⁾O₂.

1-2 Ceci dit, certaines réactions produisent de l'oxygène moléculaire dans un état différent de celui-ci ; on a

Sa durée de vie est très courte (état instable)

Mais aussi et surtout

état métastable, avec possibilité de réagir dans des conditions appropriées.

On dit que cette molécule O₂ métastable est dans un état singulet parce que, à cause des spins s = +1/2 et s = -1/2, la quantité 2s + 1 est égale à 1. Et on adopte la notation ⁽¹⁾O₂.

Au bout d'un temps plus ou moins long, par collision de deux molécules

Rappelons que ⁽³⁾O₂ est l'oxygène ordinaire.

2- On connaît plusieurs sources d'oxygène singulet. Citons-en deux

En faisant barboter du chlore dans de l'eau oxygénée en milieu basique

On peut faire un mélange d'eau de Javel et d'eau oxygénée, le résultat est le même

Par décomposition de peracides

3- Il est possible d'accroître l'intensité lumineuse de façon significative en faisant en sorte que l'énergie émise à partir de l'état singulet soit communiquée à certaines molécules aptes à la recevoir.

C'est le cas de la dibenzanthrone, appelée violanthrone

VIOLANTHRONE

Désignons par V cette molécule

VIOLANTHRONE2

E – Conclusion

La chimioluminescence, phénomène peu courant, il faut le reconnaître, se montre quelquefois utile.

C'est le cas par exemple de la détection ou du dosage de quelques substances, d'effets lumineux décoratifs et même d'éclairage de secours.

Annexe 1

1) Préparations de l'oxalate de diphényle

2 méthodes :

- Acide oxalique sur phénol avec catalyseur

On dissout 1 mol. d'acide oxalique dans de l'acide sulfurique à la concentration de 3 mol/L.

On dissout 2 mol. de phénol dans de l'acide sulfurique à la concentration de 3 mol/L.

On mélange les deux solutions.

La réaction est la suivante :

Cette réaction est réversible. Le rendement est faible et la séparation de l'oxalate de diphényle difficile.

- Le dichlorure de l'acide oxalique sur le phénol

· Préparation du chlorure d'acyle :

Dans un environnement parfaitement anhydre mettre de l'acide oxalique dans un ballon plongé dans un bain de glace (travailler sous une hotte).

On ajoute par petites quantités du trichlorure de phosphore, un liquide fumant incolore. Une fois tout le PCl₃ ajouté on chauffe la solution et on maintient un reflux durant une à cinq heures.

Durant cette réaction le chlorure d'acyle (liquide) et l'acide phosphoreux (solide) sont produits. On récupère le chlorure d'acyle par filtration. On rappelle que toutes ces opérations doivent être conduites en milieu anhydre.

Stoechiométrie de la réaction :

· Préparation de l'oxalate de diphényle :

On dissout le phénol et de la triéthylamine dans du toluène.

On refroidit cette solution dans un bain de glace puis toujours en milieu anhydre on ajoute le chlorure d'acyle par petites fractions.

Un précipité se forme immédiatement après l'ajout du chlorure d'acyle, c'est de l'oxalate de diphényle. Il faut chauffer à reflux pendant 30 minutes.

On refroidit la solution dans un bain de glace et on filtre sous vide pour récupérer les cristaux.

On lave ensuite les cristaux avec de l'hexane et de l'eau et on termine par une recristallisation dans du toluène.

Une dernière filtration sous vide et un rinçage à l'hexane.

Remarque : La triéthylamine sert seulement à capter le chlorure d'hydrogène produit par la réaction.

2) "Obtention de lumière froide"

On mélange l'oxalate de diphényle dans un solvant avec le colorant, par exemple la rhodamine B (pour obtenir du rouge).

Lorsqu'on ajoute le peroxyde d'hydrogène, l'oxalate de diphényle se décompose en phénol et en dioxyéthanedione, un peroxyde instable qui se décompose à son tour en deux moles de dioxyde de carbone.

Il se dégage l'énergie nécessaire pour activer le colorant et faire passer un électron de sa molécule à l'état excité ; il y restera un court instant puis reviendra à son état fondamental en libérant de l'énergie sous forme d'un photon dont la longueur d'onde est de 610 nm ;

ce photon dit photon de fluorescence de la rhodamine B correspond à de la lumière rouge ; pour le rubrène un autre colorant, la fluorescence correspondrait à de la lumière jaune (environ 570 nm)

Résumons par des équations chimiques :

· Action de l'oxalate de diphényle sur le peroxyde d'hydrogène

· L'énergie dégagée place le colorant utilisé (ici la rhodamine B) dans un état excité

Cyalume9